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HER2显色原位杂交法

时间:2007-12-29  作者:丁伟  阅读:17096次

                    HER2显色原位杂交法
一、预处理
1、 脱蜡至水
   二甲苯    5分钟,2 次
   100%酒精 1分钟,2 次
   95%酒精  1分钟,1 次
   85%酒精  1分钟,1 次
   双蒸水    1分钟 ,3次
2、加热预处理
   热预处理液(试剂盒内带)加热至98-100℃时,放入切片,15-20分钟。
   双蒸水洗    1分钟,3次
3、胃蛋白酶消化
   将胃蛋白酶先放入37℃温箱预热,然后滴加至组织上。
室温, 5-30分钟  (其间用显微镜观察,如果出现细胞核向外突出,有荷包蛋样改变即可停止,此步较为关键,消化不足和消化过了,都会导致假阴性或只有少量阳性)
     双蒸水 1分钟,3次
4、酒精脱水
   85%酒精 1分钟,2 次
   95%酒精 1分钟,1 次
   100%酒精 1分钟,1 次
室温或37℃温箱干燥5分钟
四、变性和杂交
1、 滴加探针:在组织中央滴加探针(约法10-15μl),将盖玻片轻轻的盖在组织上,避免产生气泡。
2、将玻片放在原位杂交仪或原位PCR仪上,如没有也可平放于铝制饭盒等底平的器皿底部。
3、95℃变性5分钟,如没有原位杂交仪或原位PCR仪,可将水烧开,拔去插座,放入铝盒,将水温控制在95℃-98℃,6分钟;也可以放入95℃烤箱内,5分钟。
4、快速冷却至37℃(如没有原位杂交仪或原位PCR仪,可将铝盒移至冰水中冷却),并将玻片移至湿盒内,37℃温箱孵育12小时。
5、杂交后,小心除去玻片,放入CAS-BlockTM阻断液或TBS/Tween20(0.025%)液内洗1分钟,然后放入75℃的CAS-BlockTM阻断液洗5分钟,TBS/Tween20(0.025%)液洗也可达到同样的效果。
6、双蒸水 1分钟,3次
五、免疫显色
   1、滴加3%甲醇双氧水液5-10分钟(室温)。
   2、TBS/Tween20(0.025%)液1分钟, 3次。
   3、滴加封闭液5-10分钟(室温)。
   4、擦去多余封闭液,滴加小鼠抗地高辛抗体室温30分钟。
   5、TBS/Tween20(0.025%)液1分钟, 3次。
   6、滴加HRP-抗鼠抗体室温30分钟。
   7、TBS/Tween20(0.025%)液1分钟, 3次。
   8、DAB显色 5-30分钟(镜下控制,以组织芯片同时达到预期强度为标准)。
   9、自来水洗。
六、衬染和封片
   1、苏木素浅染10-30秒
   2、水洗,蓝化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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