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免疫组织化学染色注意事项

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:27609次

一、抗体的保存
    浓缩抗体,在有效期以内,一般只需放在普通4 ℃ 冰箱内保存,保存时间可达5-10年以上(免疫荧光试剂例外)。最好不要用塑料管分装,因为塑料对抗体有吸附作。用-20℃至-40℃低温冰箱冷冻,由于冻融也会使抗体效价降低。而即用型抗体保存时间一般在一年以内。
用TBS稀释的抗体,一般可放置1个月。稀释比低的抗体,效价降低比较快一点,如CD系列,bcl-2,Ki-1,syn,5-HT等等;而稀释比高的抗体,如CEA,KT,CgA,CT,AFP,GFAP,S-100等等。

二、非特异性着色的原因
1.抗体稀释度过高,导致切片深染。
现象:分不清是那些细胞着色。
解决方法:找出最佳的稀释比。
2.抗体不纯,或抗体特异性不强,交叉反应较多,或抗体表达较弱。
现象:阳性细胞和阴性细胞都着色,只是阳性细胞着色略强一些。像这类情况很难有好的办法解决,可找一个背景着色较浅的试剂盒试一下,或用胰酶消化,或用微波修复。
3.抗体本身的特异性异常表达。从理论上说一种抗体只能与其相应的抗原起免疫反应,但经过长时间实验以后,发现很多组织都有“例外”的表达,目前大多用细胞的分化不同阶段其抗原性有相应的变更来解释,可能还有很多我们目前不知的原因。这种情况我们就没办法解决了。
4.抗体孵育时间过长,或孵育温度过高,导致着色过深。不能补救。
5.抗原修复不正确。

三、 背景着色的原因:
背景着色和非特异性着色有时没有一个明确的界线,现象都是背景黄。
1、内源性过氧化物酶丰富,如肝脏。解决办法用APAAP试剂盒可能好一点。
2、切片在染色过程中干燥过,特别是在孵育的过程中干燥。无法补救。
3、粘贴剂浓度过高。解决办法:再稀释。
4、抗体浓度过高,或抗体浓度过低。解决办法:找出合适的稀释比。
5、显色剂浓度过高,或显色时间过长。解决办法:显色剂称量要准确,并找出合适的浓度,显色时镜下控制。
6、 缓冲液洗涤不够干净。解决办法:多清洗一点时间,减少从上一缸带到下一缸的残液,缓冲液每次用过都要更换。
7、 浸蜡温度过高,烤片温度过高或烤片时间过长。解决办法:用60℃以下的温箱浸蜡和烤片,烤片时间在4~8小时内。
8、 福马林固定时间过长。解决办法:流水冲洗。

四、着色不匀的原因
1. 脱蜡不干净。
2. 抗体或显色剂加的太少,有的地方没覆盖到,或有的部位已干燥。
3. 显色剂(DAB)用前没过滤。
4. 湿盒不平,导致切片倾斜,有的部位已干燥。
5. 抗体稀释时没打匀。
6. 抗体发霉,或稀释抗体用的缓冲液发霉。

五、出现假阴性的原因
1、固定时间过长,浸蜡、烤片温度过高,导致抗原丢失,无法补救。
2、固定液不合适,或浓度不对,导致固定不佳。
3、第一抗体没加。补救办法:染过的片子用缓冲液洗干净后,再加一抗,按步骤重新染过。
4、第一抗体加错。如加错的抗体和你要加的抗体是不同类型的二
抗,那原片子用缓冲液洗干净后,再加一抗,可能还能补救。
5、二抗没加,或二抗加错。补救办法:染过的片子用缓冲液洗干净后,再加二抗,关系不大。
6、DAB显色剂里双氧水没加,现象是全部不着色,加双氧水后再显色。
7、抗体浓度过低。补救办法:增加抗体浓度,染过的片子用缓冲液洗干净后,加一抗再染。
8、孵育的时间太短,没按要求时间孵育,从一抗开始重新染过。
9、孵育温度太低。解决办法:保证温箱温度在37℃,或增加孵育时间,如一抗4℃过夜。
10、抗体本身的特异性。有的抗体在正常组织中表达很强,而肿瘤时表达很弱,或不表达。
11、修复方法有误,或处理时间不正确。
12、缓冲液pH值不正确。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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