急!请版主和各位老师帮忙看看
我做的是石蜡荧光免疫标记,步骤如下:
(1)切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。
(2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0,1000ml)微波抗原修复
(3)冷却至室温 ,片子经蒸馏水冲洗二次,之后用TBS(PH7.5)冲洗3次,每次30分
(4)入含0.1M NH4Cl的TBS中1小时;
(5)0.5%Tween20的TBS浸洗3次,每次30分钟;
(6)用含10mM甘氨酸的TBS浸洗3次,每次10分钟;
(7)浸入含10%脱脂奶粉和lOmM甘氨酸的TBS中,置4℃冰箱中过夜。
(8)与一抗(1:100稀释)室温作用1-2小时。一抗用含0.02% Tween20,10%脱脂奶粉和10mM甘氨酸的TBS稀释;
(9)用含10%脱脂奶粉和10mM甘氨酸的TBS浸洗3次,每次20分钟,然后与二抗(FITC标记,购自博士德公司)(1:64稀释) 湿盒避光室温作用一小时。二抗用含0.02%Tween20,10%脱脂奶粉和10mM甘氨酸的TBS稀释;
(10)湿盒避光用TBS洗3次,每次20分钟(在摇床上漂洗)
请版主和各位老师帮忙看看有无重大问题或不当的地方,现在已经进行到第(10)步,感觉材料上脱脂奶粉沉积, 浸洗两次了还是乳白色的 ,封片有影响吗?还有封片是不是要晾干再封?先谢了