我在做SD大鼠皮肤的免疫组化，TRP1，应该在黑素细胞的胞浆中着色，重复了多次，表皮均未见阳性细胞，但在真皮毛囊看到棕黄色沉积。
请问这是怎么回事呀？
实验操作步骤是按说明书的（中杉公司，三步法）；
抗体稀释1：200；
胞浆内的抗体染色一定要破膜吗？

另外：我现在用免疫荧光直接法再做做看，有意义吗？敏感性会强一些吗？

我本来一点都不懂免疫组化的，为了做课题，也看了一些资料，现在碰到的问题真不知该怎么办了！请各位帮帮忙吧！

[ 本帖最后由 bobo3 于 2007-5-4 20:47 编辑 ]

要把阳性与黑色素细胞的胞浆的黑色区别好。

免疫荧光有意义。

谢谢shanghainese 斑竹！

引用:

要把阳性与黑色素细胞的胞浆的黑色区别好。

不明白斑竹的意思。是说“真皮毛囊看到棕黄色沉积”是非特异性染色吗？

另外，还想请教一下：如果本来毛囊中的黑素细胞含TRP1 要比表皮中的高，那我现在毛囊中的黑素细胞染出来了（假设棕黄色沉积是阳性黑素细胞），而表皮中的黑素细胞没有染出来，是否与一抗的浓度有关系？增加一抗的浓度（比如增加到1：100）是否有可能也把表皮中的黑素细胞染出来？做个1:100的有意义吗？

（对免疫组化不是很懂，以前也是，自己想到什么可能失败的原因，就再改一下，但仍旧没有满意的结果，不经意间看到了这个网站，碰到了可以咨询的老师，就想多问一些！！谢谢）

免疫组化DAB显色出来阳性黑色素细胞里的酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP1）在与黑色素细胞的胞浆的黑色素是很难区别的。
我要是您，一定用免疫荧光。 因为这样比较容易辨别阳性。

谢谢老师！
要是做出结果来了，再向老师汇报！


免疫荧光直接法步骤：
1.冰冻切片按要求进行固定，然后水化，用0.01 mol/L PH7.2-7.4 PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
2.滴加经稀释的荧光抗体，37度 30-60分钟或4度过夜。
3.PBS洗2次，蒸馏水洗1次
4.50%甘油缓冲液封片

请问：
1.以上是我在网上找到的步骤，对吗？
2.我的TRP1 说明书上说可以做免疫荧光的，是不是直接加稀释的（1：200）TRP1 就可以了吗？还是要另外加荧光标记之类的？
3.抗原        固定剂             固定方法
  蛋白质      95% 乙醇        室温3-10分钟或4度30分钟
  Ig类         甲醇                   同上
  酶类         丙酮                   同上
我应该用哪种固定剂呀？
谢谢！！！

[ 本帖最后由 bobo3 于 2007-5-5 15:42 编辑 ]

是不是应该用丙酮阿？请有经验的不吝赐教~~

用丙酮。

谢谢各位的帮助

引用:

原帖由 bobo3 于 2007-5-4 20:42 发表
我在做SD大鼠皮肤的免疫组化，TRP1，应该在黑素细胞的胞浆中着色，重复了多次，表皮均未见阳性细胞，但在真皮毛囊看到棕黄色沉积。
请问这是怎么回事呀？
实验操作步骤是按说明书的（中杉公司，三步法）；
抗体 ...